в чем измеряется протеолитическая активность

Протеолитическая активность: определение, функции, значение для организма и классификация протеаз

Протеазы (протеиназы, пептидазы и протеолитические ферменты) играют очень важную роль в жизни человека. На сегодняшний день в человеческом организме определено более 500 этих ферментов, которые кодируются на 2 % всех генов. Протеолитическая активность наблюдается во всех формах жизни и вирусах.

Основная классификация

На основе каталитического остатка протеазы можно разделить на 7 обширных групп:

Протеазы сначала были собраны в 84 семьи, согласно их протеолитической активности, и расклассифицированы под 4 каталитическими типами:

Значение

Биологические функции

Протеолитическая активность обладает следующими функциями:

Ферменты

Протеолитические ферменты присутствуют в бактериях, вирусах, некоторых типах водорослей и растений. Но больше всего их в животных. Существуют различные типы протеолитической активности ферментов. Они классифицируются в соответствии с участками, в которых катализируется расщепление белков. Двумя основными группами являются эгзопептиды и эндопептидазы. Внутри организма материалы протеина первоначально атакованы пепсином. Когда белок передается в тонкую кишку, он частично переварен желудком. Здесь он подвергается воздействию протеолитических энзимов, выделяемых поджелудочной железой. Затем панкреатические ферменты активизируются в кишечнике, превращая белки в аминокислоты, которые легко всасываются его стенками. Таким образом, поджелудочная железа защищена от самопереваривания.

Бактерии

Микробные протеазы одна из важных групп в составе промышленно-коммерческого производства энзимов. Были проведены исследования для определения протеолитической активности бактерий с целью выяснить их роли внутри патогенеза инфекционных заболеваний. Основное внимание уделялось обследованию молочнокислых бактерий из различных йогуртов и ферментированного молока. Они широко распространены в природе. Это лактобактерии, лактококки, бифидобактерии, стрептококки, энтерококки и споролактобактерии. Они разделяются по видам, подвидам, вариантам и штаммам.

Пептины

Протеолитическая активность пепсина измеряется под влиянием магнитного поля на организм. Молекулярная структура пепсина характеризуется D-пространственной симметрией. Неактивный пепсиноген проэнзима синтезируется внутри клеток слизистой оболочки желудка. Также он присутствует в различных биологических жидкостях (кровь, моча, семенная и спинномозговая жидкость). Пепсиноген характеризуется автокаталитической активацией. Его секреция стимулируется блуждающим нервом, симпатическими волокнами, гастрином, гистамином, секретином и холецистокинином. Гастрин действует как стимулятор теменных клеток. Этот полипептид существует в 2 формах, содержащих 34 и 17 аминокислот. Измерения протеолитической активности пепсина в отношении к стандартному гемоглобину выявили аналогичные изменения в пищеварительной активности фермента.

Протеолиз и болезни

Аномальная протеолитическая активность связана со многими заболеваниями. При панкреатите утечка протеаз и их преждевременная активация в поджелудочной железе приводит к самовоспламенению поджелудочной железы. Люди с сахарным диабетом могут иметь повышенную активность лизосом, деградация некоторых белков может существенно увеличиться. Хронические воспалительные заболевания (ревматоидный артрит) могут привести к высвобождению лизосомальных ферментов в межклеточное пространство. Это разрушает окружающие ткани. Дисбаланс между протеазами и антипротеазами может привести к разрушению ткани легких при эмфиземе, вызванной курением табака.

Другие заболевания включают мышечную дистрофию, дегенерацию кожи, дыхательные и желудочно-кишечные заболевания, злокачественные опухоли.

Неферментативный протеолиз

Основа белка очень стабильна в воде при нейтральном РН и комнатной температуре, хотя скорость гидролиза разных пептидных связей может различаться. Полупериод распада скрепления пептида колеблется от 7 до 350 лет.

Методика определения

Экспериментальная процедура

Протеазы в качестве противовирусных агентов

В настоящее время существует ряд одобренных препаратов с протеолитической активностью для применения при лечении вирусных инфекций. Большинство из них используется главным образом для лечения инфекций герпесвируса, вируса иммунодефицита человека, респираторно-синцитиальных инфекций и вируса гриппа А. Это нуклеозидные аналоги, которые действуют путем ингибирования синтеза вирусной ДНК.

Исследования последнего десятилетия показали, что протеазы являются абсолютным требованием в жизненном цикле многих вирусов. Влияние происходит либо путем расщепления высокомолекулярных белков-предшественников с получением функциональных продуктов, либо путем катализа структурных белков, необходимых для сборки и морфогенеза вирусных частиц.

На сегодняшний день утверждены четыре ингибитора протеазы:

Другие препараты

Пикорнавирусные протеазы составляют одно из крупнейших семейств, важных с медицинской точки зрения человеческих патогенов. Энтеровирусы связаны с различными клиническими синдромами, включая заболевания верхних дыхательных путей, асептический менингит, энцефалит, миокардит, болезни рук, ног и рта. В этом случае помогут протеазы. Отхаркивающие средства, обладающие протеолитической активностью:

Еще одним потенциальным антириновирусным препаратом является «Плеконарил».

Источник

В чем измеряется протеолитическая активность

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Метод определения протеолитической активности

Enzyme preparations for food industry.
Method for determination of proteolitic activity*

* Поправка. ИУС N 9-2015, Измененная редакция, Изм. N 1.

Дата введения 2012-01-01

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевой биотехнологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 176 «Спиртовая, дрожжевая и ликероводочная продукция»

ВНЕСЕНА поправка*, опубликованная в ИУС N 9, 2015 год

* См. ярлык «Примечания».

Поправка внесена изготовителем базы данных

ВНЕСЕНО Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Приказом Росстандарта от 29.09.2015 N 1401-ст c 01.01.2016

Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 1, 2016 год

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения протеолитической активности в ферментных препаратах в кислой, слабокислой, нейтральной и щелочной зонах рН действия ферментов с использованием в качестве субстрата гемоглобина.

Установленный в настоящем стандарте метод может быть использован для определения протеолитической активности ферментных препаратов и ферментсодержащих смесей, используемых в пищевой промышленности.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4109-79 Реактивы. Бром. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10678-76 Кислота ортофосфорная термическая. Технические условия

ГОСТ 10931-74 Реактивы. Натрий молибденовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначение чистоты

ГОСТ 18289-78 Реактивы. Натрий вольфрамовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 18481-81 Ареометры и цилиндры стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 20264.0-74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на более простые в присутствии молекулы воды.

3.3 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

3.5 системные названия ферментов: Названия, указывающие природу химической реакции, катализируемой данным ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ), принятой Международной комиссией по ферментам.

Системные названия ферментов

Протеазы подразделяют на две основные группы: пептидазы (КФ 3.4.11-3.4.15) и протеиназы (КФ 3.4.21-3.4.24) [1].

Пептидазы (КФ 3.4.11-3.4.15) экзодействия катализируют гидролиз пептидной связи с N- и (или) С-конца пептидной цепи;

— дипептидилпептидгидролазы (КФ 3.4.14) и пептидилдипептидгидролазы (КФ 3.4.15) катализируют расщепление дипептидов с N-и С-конца пептидной связи до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.

Протеиназы (КФ 3.4.21-24) катализируют гидролиз пептидных связей полипептидной цепи с образованием пептидов с различной молекулярной массой:

4 Метод определения протеолитической активности в кислой и слабокислой, нейтральной и щелочной зонах рН*

4.1 Характеристика метода*

4.1.2 За единицу общей протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 °С приводит гемоглобин в неосаждаемое состояние ТХУ в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг); активность выражается в ед.ПС/г или ед.ПС/см испытуемого препарата.

Источник

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ СОЛОДА

Цель работы:освоить методику определения активности протеолитических ферментов солода.

Общие положения

Протеиназы гидролизуют непосредственно белок. Из белка обра­зуются полипептиды и свободные аминокислоты. К этой группе протеиназ принадлежат ферменты пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин, фицин, ренин и др.

Тиоловые протеиназы (КФ 3.4.22), содержащие в активном центре цистеин, представлены в основном растительными протеиназами. В эту группу входят папаин, бромелаин и фицин.

Принцип действия протеолитических ферментов на субстраты

В процессе действия протеолитических ферментов на субстраты решающую роль, прежде всего, играет структура молекул субстрата, соответствующая часть молекулы субстрата, в которой происходит разрыв пептидной связи.

В качестве белковых субстратов наиболее широко используют же­латин, казеин, гемоглобин, сывороточный альбумин, кератин, эластин.

Протеолитическая активность характеризует способность фермен­тов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г твердых или в 100 см 3 жид­ких ферментных материалов.

Для характеристики ферментных препаратов и оценки их качества предлагаются методы, основанные на двух способах определения про-теолитической активности.

Метод Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1 г препарата или 1 см 3 ферментного раствора за 1 час при температуре 40 0 С.

За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 час при принятых условиях опыта.

Аппаратура и реактивы: Водяная баня; весы технические; термометр; конические колбы вместимостью 50-100 см 3 ; мерные цилиндры; пипетки; титровальная установка с микробюреткой; фосфатный буфер с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт; дистиллированная вода.

Приготовление фосфатного буфера с рН 7,3-7,5. Готовят из двух растворов: а) 11,876 г гидроортофосфата натрия Na₂HPO₄·2Н₂О в 1 дм 3 дистиллированной воды; б) 9,078 г безводного дигидроортофосфата калия КН₂РО₄ в 1 дм 3 дистиллированной воды. Состав фосфатной смеси: 80 частей раствора Nа₂НРО₄ и 20 частей раствора КН₂РО₄.

Приготовление 1%-ного спиртового раствора тимолфталеина. 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96%-ном этиловом спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см 3 и после растворения доводят до метки, закрывают пробкой и хранят в темном месте.

Приготовление 0,1 н раствор гидроксида натрия. 4 г кристаллического NаОН растворяют в 1 дм 3 дистиллированной воды. Определить поправку к титру.

Приготовление ферментной вытяжки. В колбе смешивают 1 часть солода с 5 частями дистиллированной воды температурой 37 0 С. Колбу плотно закрывают пробкой и содержимое взбалтывают в течение 1 часа на аппарате или вручную. Смесь фильтруют, перефильтровывая первые порции фильтрата, и для анализа используют прозрачный фильтрат.

Порядок проведения работы

Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле:

где А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение в пересчете на 1 г солода или 1 см 3 жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле:

где а – количество 0,1 н раствора NаОН, пошедшее на титрование 1 см 3 опытной пробы, см 3 ;

а_к – то же, для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в милиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Следовательно: А = (1,08 – 0,68)1,4 ·1,06 = 0,59 мг.

Тогда ПС = А / (t · Р) = 0,59 · 12 · 100 / (3 · 1 · 2 · 10) = 11,8 ед на 1 г культуры.

Пересчет протеолитической активности на сухое вещество культуры ведется по формуле:

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Назовите продукты гидролиза белка под действием протеиназ.

2. Какие ферменты относятся к группе протеиназ?

3. От чего зависит скорость расщепления белка протеолитическими ферментами?

4. Что используют в качестве белковых субстратов для определения протеолитической активности?

5. Какие способы определения протеолитической активности вы знаете и на чем они основаны?

Лабораторная работа №9

Дата добавления: 2018-04-05 ; просмотров: 2141 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

В чем измеряется протеолитическая активность

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Метод определения протеолитической активности

Enzyme preparations for food industry. Method for the determination of proteolitic activity

Дата введения 2019-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2018 г. N 53-2018)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 августа 2018 г. N 509-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34430-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2019 г.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения протеолитической активности в ферментных препаратах в кислой, слабокислой, нейтральной и щелочной зонах рН действия ферментов с использованием в качестве субстрата гемоглобина.

Установленный в настоящем стандарте метод может быть применен для определения протеолитической активности ферментных препаратов и ферментсодержащих объектов, используемых в пищевой промышленности.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 12.4.103-83 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003* Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10678-76 Кислота ортофосфорная термическая. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначение чистоты

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18321-73 Статистический контроль качества. Методы случайного отбора выборок штучной продукции

ГОСТ 18481-81 Ареометры и цилиндры стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 18995.1-73 Продукты химические жидкие. Методы определения плотности

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на более простые в присутствии молекулы воды.

3.3 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует фермент.

3.5 системные названия ферментов: Названия, указывающие природу химической реакции, катализируемой ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ), принятой Международной комиссией по ферментам [1] (см. приложение А).

4 Сущность метода

4.2 За единицу общей протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при температуре 30°С приводит гемоглобин в не осаждаемое ТХУ состояние в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг). Активность выражают в ед. ПС/г или ед. ПС/см ферментного препарата.

4.3 Количество белка, превращенного в низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, определяют по реакции свободных аминокислот с реактивом Фолина и дальнейшим определением оптической плотности образующихся голубых растворов на фотоэлектроколориметре при длине световой волны =670 нм.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы, материалы

Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности с ценой поверочного деления 0,1 мг и пределом допускаемой погрешности ±0,15 мг.

Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр любого типа, который обеспечивает измерение оптической плотности анализируемых растворов при длине световой волны =670 нм с погрешностью измерения коэффициента пропускания ±1% в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

рН-метр любого типа для измерения в диапазоне от 0 до 14 ед. рН с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,1 ед. рН.

Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

Ультратермостат или термостат водяной с точностью регулирования температуры ±1°С.

Секундомер с емкостью шкалы счетчика 1 мин, ценой деления 1 с и погрешностью ±1,5 с.

Встряхиватель для перемешивания жидкости со скоростью вращения гнезда от 50 до 3000 об/мин.

Термометры ртутные стеклянные лабораторные от 0 до 50°С и от 0 до 100°С с ценой деления 0,1 или 0,5°С по ГОСТ 28498.

Ареометры общего назначения по ГОСТ 18481.

Стаканы стеклянные В-1-100 ТС, В-1-150 ТС, В-1-800 ТС по ГОСТ 25336.

Колбы стеклянные конические Кн-1-100-14/23 ТС, Кн-1-250-24/29 ТС по ГОСТ 25336.

Источник

ГОСТ 20264.2-88
Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности

Купить ГОСТ 20264.2-88 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль»

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

Распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения.

Ограничение срока действия снято: Протокол № 3-93 МГС от 12.03.93 (ИУС 5-93)

Оглавление

1 Методы отбора проб

2 Метод определения протеолитической активности (ПС) (модифицированный метод Ансона)

3 Определение протеолитической активности методом ФОЛП (для определения щелочных протеиназ при рН 10,5)

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

Enzyme preparations. Methods for the determination of proteolytic activity

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Цена 5 коп. БЗ 1—88/33

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ Москва

УДК 574.15.001.4:006.354 Группа С09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы определения протеолитической активности

Enzyme preparations. Methods for determination of proteolytic activity

Срок действия с 01.01.89 до 01.01.94

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения.

1 МЕТОД ОТБОРА ПРОБ —по ГОСТ 20264.0-74.

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПС) (модифицированный метод Айсона)

2.1. Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с последующим их определением.

За единицу протеолитической активности принята способность фермента превращать за 1 мин при температуре 30°С казеинат натрия в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина.

Протеолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при значениях pH в следующих диапазонах:

2,5±0,2 и 5,5±0,2 — кислые протеиназы;

7,2±0,2 — нейтральные протеиназы;

9,5±0,2 — щелочные протеиназы.

Издание официальное Перепечатка воспрещена

© Издательство стандартов, 1988

натрия концентрацией 0,5 моль/дм 3 и по 1 см 3 рабочего раствора Фолина, непрерывно перемешивают, выдерживают в ультратермостате (для разв’йтия окраски) при температуре 40°С в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры, затем фотометри-руют при длине волны 630—670 нм при использовании кювет с толщиной поглощающего свет слоя 5 мм.

Оптическую плотность испытуемых растворов измеряют по отношению к контрольной пробе (воде).

Значение оптической плотности для ферментных препаратов должно находиться в диапазоне 0,15—0,70.

В случае отклонения оптической плотности от указанной необходимо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая плотность укладывалась в данные пределы.

3.4. Обработка результатов

где D —значение оптической плотности испытуемых растворов; т — масса ферментного препарата в фильтрате, взятом для развития окраски мг;

4,7 и 0,1 —постоянные коэффициенты, полученные экспериментально, г/ч;

1000 — переводной коэффициент милиграмм в граммы.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата.

Относительное допускаемое расхождение между значениями активностей двух параллельных навесок не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений относительной погрешности измерений протеолитической активности при доверительной вероятности Р = 0,95 составляет 5%.

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством медицинской и микробиологической промышленности СССР

А. Н. Саприн, д-р. биолог, наук; А. В. Гарбузов, канд. биолог, наук; В. М. Лаврухина

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 02.03.88 № 440

3. Срок первой проверки — 1992 г.

Периодичность проверки — 5 лет

б. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Номер раздела, пункта

2.2 2.2 2.2 2,2 2,2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2

Обозначение НТД, на который дана ссылка

С. СЕЛЬСКОЕ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

Изменение № 1 ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности

Утверждено и введено в действие Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 21.12.89 М 3952

Дата введения 01.07.90

Пункт 2.2. Заменить ссылку: ГОСТ 24104-80 на ГОСТ 24104-88; исклю* *шть ссылку: ГОСТ 5850-72.

(Продолжение см. с. 296) (Продолжение изменения к ГОСТ 20264.2-88)

Пункт 2.4. Экспликация к формуле. Заменить единицу и слова: см 3 /мкмоль на мкмоль/см 3 ; 3 ферментного раствора), мг».

Редактор Н. В. Бобкова Технический редактор Я. Я, Дубина Корректор Е. А. Богачкова

Сдано в наб. 21,00.88 Подп. в печ. 03.Q5.88 1,0 уел. п. л. 1,0 уел. кр.-отт. 0,73 уч,-Тираж 8 000 Цена

Ордена «Знак Почета» Издательство стандартов, 123840, Москва, ГСП, Новопресненский пер., 3 Тип. «Московский печатник». Москва, Лялин пер., 6. За к. 2068

2.2. Аппаратура, материалы, реактивы, раство-

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80:

2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;

1-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г или 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 20 г.

Прибор для определения pH среды в диапазоне от 0 до 14 с погрешностью измерения ±0,1 единиц pH.

Мешалка магнитная любого типа, обеспечивающая 3000 об/мин.

Термостат любого типа, обеспечивающий температуру нагрева 40±0,2°С.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный по ГОСТ 12083-78, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 630—670 нм с погрешностью ± 1 % (по коэффициенту пропускания) или 0,01 D (по оптической плотности).

Термометры 0—150°С по ГОСТ 215-73 с ценой деления 1°С.

Холодильник бытовой любой марки.

Электроплитка с терморегулятором по ГОСТ 14919-83.

Баня водяная любого типа.

Холодильник ХСВО 10 ХС по ГОСТ 25336-82.

Стаканы любого типа и исполнения вместимостью 100, 250, 600, 1000 и 2000 см 3 по ГОСТ 25336-82.

Стаканчики для взвешивания СВ-19/9 или СВ-24/10 по ГОСТ 25336-82.

Колбы типов П и Кн любого исполнения вместимостью 100, 250, 500, 1000 см 3 по ГОСТ 25336-82.

Колбы типов К—1—2000—45/40 ТС, К- 2- 200—45/40 ТС по ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные исполнения 1 или 2, любого класса точности, наливные вместимостью 50, 100, 200, 250, 500, 1000 и 2000 см 3 по ГОСТ 1770-74.

Пробирки П1—46—150 ХС, П2—16—180 ХС по ГОСТ 25336-82.

Цилиндры любого исполнения вместимостью 50 и 100 см 3 по ГОСТ 1770-74.

Пипетки любого исполнения вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 3 по ГОСТ 20292-74.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336-82.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.

Натрий вольфрамовокислый 2-водный по ГОСТ 18289-78.

Натрий молибденовокислый по ГОСТ 10931-74.

Натрий казеиновокислый (казеинат натрия).

Кислота трихлоруксусная (ТХУ).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

1. Все реактивы должны быть марки х. ч. или ч. д. а, кроме трихлоруксус-ной кислоты, которая используется марки ч.

2 Допускается использование импортной посуды и приборов с аналогичными техническими характеристиками.

2.3. Подготовка к испытанию

Для приготовления универсального буферного раствора У61 готовят растворы концентрацией 0,1 моль/дм 3 : уксусной кислоты (раствор А), ортофосфорной кислоты (раствор В) и борной кислоты (раствор С) и смешивают их в равных соотношениях. Получают буферный раствор с pH 1,8. Добавляя к этой смеси различные объемы раствора гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм 3 получают буферные раство-ры:

а) pH реакционной смеси 2,5±0,2 и 5,5±0,2 (для кислых про-теиназ);

б) pH реакционной смеси 7,2±0,2 (для нейтральных протеи-наз);

в) pH реакционной смеси 9,5±0,2 (для щелотых протеиназ).

Для приготовления универсального буферного раствора Уб₂ готовят растворы А, В и С концентрацией 0,5 моль/дм 3 и смешивают их в равных соотношениях.

2.3.3. Приготовление универсального буферного раствора Уб₅ концентрацией 0,01 моль/дм 3

Универсальный буферный раствор Убз готовят смешиванием девяти объемов дистиллированной воды с одним объемом буферного раствора Убь

2.3.4. Приготовление реактива Фолина (основной раствор)

Для приготовления основного раствора Фолина в круглодонную

колбу с пришлифованным обратным холодильником вместимостью 2000 см 3 наливают 700 см 3 дистиллированной воды, добавляют

100,00 г вольфрамо’вокислого натрия и 25,00 г молибденовокислого натрия. Затем приливают 50 см 3 ортофосфорной кислоты с массовой долей 85% и 100 см 3 концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят на слабом огне на асбестовой сетке в течение 10 ч. Кипячение допускается прерывать.

В охлажденную смесь добавляют 150,00 г сернокислого лития, 50 см 3 дистиллированной воды и пять капель брома. Открытую колбу кипятят на слабом огне под тягой в течение 15—20 мин, чтобы удалить избыток паров брома. Раствор должен иметь желтую окраску. После охлаждения раствор доводят дистиллированной водой до 1000 см 3 (при необходимости фильтруют через трубку Аллина, заполненную стеклянной ватой).

Приготовленный раствор хранят в склянке из темного стекла в холодильнике. Через 2—3 мес хранения следует добавить в него 1—2 капли брома и снова прокипятить в течение 15—20 мин Показателем непригодности раствора считается его помутнение и изменение окраски из желтой в зеленую.

Рабочий раствор Фолина готовится разведением основного раствора 1 :2 (одна часть реактива Фолина и две части дистиллированной воды) для определения активности модифицированным методом Ансона и 1 : 3 (одна часть реактива Фолина и три части дистиллированной воды) для определения активности методом ФОЛП.

2.3.5. Приготовление раствора ферментного препарата

Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях. Для испытания берут две параллельные навески препарата.

Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

2.3.6. Приготовление раствора с массовой долей казеината натрия 2% (субстрат).

2.3.6.1. Для кислых прот еиназ (pH 2,5)

Добавление соляной кислоты (до pH 3,0) следует проводить быстро при интенсивном перемешивании раствора. При дальней-шем подкислении раствора до pH 2,5 кислота вносится по каплям.

Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят объем до метки буферным раствором У61 с pH 2,5.

Примечание. При подкислении раствора казеината натрия соляной кислотой первоначально (при значении pH в диапазоне 5,1—3,0) наблюдается образование мелких хлопьев, которые исчезают при дальнейшем добавлении соляной кислоты до pH 2,5.

2.3.6.2. Для кислых (pH 5,5), нейтральных (pH 7,2) и щелочных (pH 9,5) протеиназ

Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят объем до метки буферным раствором У61 соответствующего pH.

1. Для сокращения времени растворения казеината натрия раствор готовят при нагревании до температуры 70°С на магнитной мешалке.

2. Срок хранения раствора в холодильнике в плотно закрытой склянке не более 3 сут.

2.3.7. Проведение испытания

Берут три пробирки (одна контрольная, две опытные).

В опытные пробирки наливают по 2 см 3 субстрата и помещают их в ультратермостат при температуре 30°С.

Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 2 см 3 раствора фермента (предварительно термостатированного при 30°С 3—4 мин), пробирки встряхивают и оставляют на шдро-

лиз ровно на 10 мин при температуре 30°С. Через 10 мин добавляют в обе пробирки по 4 см 3 раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и для обеспечения полного осаждения выдерживают пробирки со смесью при температуре 30°С еще в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют в сухие пробирки. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Отбирают в пробирки с предварительно налитыми туда 5 см 3 раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм 3 по 1 см 3 фильтрата, перемешивают и быстро приливают по 1 см 3 рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакционной смеси постоять 20 мин. После реакции растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяют фотоэлектрическим колориметром против контроля.

Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: для этого в контрольную пробирку наливают 2 см 3 ферментного раствора того же разведения, как и в опыте, добавляют 4 см 3 ТХУ, выдерживают в ультратермостате при температуре 30°С в течение 10 мин, а затем вносят 2 см 3 субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют, отбирают в сухую пробирку с предварительно налитыми туда 5 см 3 раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм 3 1 см 3 фильтрата, перемешивают, добавляют 1 см 3 рабочего раствора реактива Фолина.

Колориметрирование проводят фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630—670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Значения оптической плотности должны лежать в диапазоне 0,07—0,45 для кислых протеиназ и 0,2—0,6 для нейтральных и щелочных протеиназ

При отклонении оптической плотности от указанной необходимо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая плотность укладывалась в данные пределы.

2.3.8. Построение градуировочной характеристики

Для вычисления протеолитической активности строят градуировочную характеристику по тирозину и по ней вычисляют тирозино-вый эквивалент (ТЭ), то есть ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см 3 стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждой новой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектрического колориметра.

Последующие растворы готовят аналогичным образом: раствор 2 : 2 см 3 исходного раствора с₂ — 0,4 • 10“ 4 моль/дм 3 или 0,04 мкмоль/см 3 ;

раствор 3:4 см 3 исходного раствора с₃ — 0,8-10

4 моль/дм 3 или 0,08 мкмоль/см 3 ;

раствор 5:7,5 см 3 исходного раствора с$—1,5 • 10″ 4 моль/дм 3 или 0,15 мкмоль/см 3 ;

раствор 6:10 см 3 исходного раствора с_б — 2,0 • 10

4 моль/дм 3 или 0,20 мкмоль/см 3 ;

Затем берут 7 пробирок, вносят в каждую по 1 см 3 раствора тирозина разной концентрации и добавляют при постоянном пере-мешивании по 5 см 3 раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм 3 и 1 см 3 рабочего раствора Фолина.

Контрольный опыт готовят также, но вместо раствора тирозина берут 1 см 3 дистиллированной воды. Дают реакционной жидкости постоять в течение 20 мин.

Интенсивность окраски измеряется фотоэлектрическим колориметром против контрольной пробы в диапазоне длин волн 630— 670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Следует приготовить растворы из двух навесок тирозина и провести два параллельных опыта способом, указанным выше.

По средним данным, полученным из двух опытов, строится градуировочная характеристика, имеющая линейную зависимость.

2.4. Обработка результатов

Протеолитическую активность (ПС), ед/г, вычисляют по фор-муле

где D — оптическая плотность исследуемого раствора;

4 — отношение объемов реакционной смеси и раствора фер

мента после добавления ТХУ;

ТЭ — тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочной характеристике, см 3 /мкмоль;

10 —время гидролиза субстрата, мин;

т — масса ферментного препарата, взятая на протеолиз, мг;

1000 — переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферментного препарата.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата.

Относительное допускаемое расхождение между значениями активностей двух параллельных навесок не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений относительной погрешности измерений протеолитической активности при доверительной вероятности Р = 0,95 составляет 5%.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МЕТОДОМ ФОЛП (для определения щелочных протеиназ при pH 10,5)

За единицу протеолитической активности принята способность фермента катализировать гидролиз 1 г белка (казеина) в строго определенных условиях: температуре 40°С, pH 10,5 и времени

3.1. Ап п а р ату р а, материалы, реактивы, растворы

Применяемая аппаратура и материалы по п. 2 2.

Казеин по Гаммерстену.

Реактив Фолина по п. 2.3.4.

3.2. Подготовка к испытанию

3.2.1 Приготовление раствора ферментного препарата

Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях.

Для испытания берут две параллельные навески препарата.

Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

3.2.2. Приготовление карбонатно-бикарбонатного буферного раствора с pH 10,7

Для приготовления буферного раствора в мерную колбу вместимостью 200 см 3 наливают 45 см 3 раствора углекислого натрия концентрацией 0,2 моль/дм 3 и 5 см 3 раствора двууглекислого натрия. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

3.2.3. Приготовление раствора с массовой долей казеина 1% ( субстрат)

3.3. Проведение испытания

В 3 пробирки (одна контрольная) наливают по 5 см 3 раствора казеина и выдерживают в ультратермостате при температуре 40°С в течение 5 мин.

В первую пробирку (контрольную) добавляют 2,5 см 3 дистиллированной воды, в последующие — по 2,5 см 3 испытуемого раствора ферментного препарата.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 60 мин при температуре 40°С.

По истечении времени гидролиза в каждую из пробирок, начиная с первой (контрольной), добавляют по 5 ом 3 раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза.

Смесь быстро перемешивают и цля полноты осаждения выдерживают в течение 15 мин при температуре 40°С в ультратермостате Затем растворы фильтруют через фильтровальную бумагу и в фильтрате определяют количество прогидролизованного белка по тирозину. Для этого берут три пробирки и в каждую (начиная с контрольной) наливают по 2 см 3 фильтрата, затем медленно приливают в каждую по 5 см 3 раствора углекислого

Источник